电转百科指南：CRISPR基因编辑的转染技巧与注意事项（下）
转自：优宁维抗体专家
02/下篇
Knock-in
对于Knock-in，目前还存在一定的难度，大多数的出版物只能实现10-40%的敲入效率，不同位点也存在差异。NatureBiotechnology今年5月的一篇出版物利用独有的SLEEK(SeLectionbyEssential-geneExonKnock-in)技术可以在T细胞上实现超过90%的KI效率，同样在其他常用的免疫细胞如NK，Bcell，IPSC等细胞都实现了非常高的KI效率。
对于常规的KI实验，我们依然可以从以下方面考量进行进一步优化：
DonorDNA用量的测试
▲ TheodoreLRothetal.,2018
▲ ZeldaOdéetal.,2020
HA长度
HA的长度会影响KI的效率，但并不意味着越长越好。
▲ ZeldaOdéetal.,2020
▲ SoyoungA.Ohetal.,2022
HA修饰
▲ BrianR.Shyetal.,2021
▲ JonasKathetal.,2022
特殊成分提高HDR效率的测试
也有文献结果表明PGA对KI的效率没有帮助，仅供参考。
▲ Ya-WenFuetal.,2021
▲ DavidN.Nguyenetal.,2020
选择dsDNA或ssDNA或AAV载体进行KI
dsDNA会随着用量的增加显著增加对细胞活率的影响。
▲ TheodoreLRothetal.,2018
HDREnhancer
▲ JonasKathetal.,2022
甚至HDR,RNP,细胞的混匀顺序也可能会对结果造成影响
▲ TheodoreLRothetal.,2018
电转前后培养体系
▲ TheodoreLRothetal.,2018
Nucleofection条件优化
通常可以参考KO的条件进行KI实验，但依然可以依照具体的实验需求调整。
▲ TheodoreLRothetal.,2018
▲ SoyoungA.Ohetal.,2022
对于Knock-in，还可以通过其他手段提升结果，如PAMandTrackmutations,具体内容可以参考如Cas蛋白或sgRNA供应商。
通常KO不会对细胞的活率产生太大影响，但是对于KI，需要用到donorDNA，如dsDNA，或者使用更强的电转染条件，这些可能会导致活率的负面影响。
[参考文献]
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DavidN.Nguyen etal.,Polymer-stabilizedCas9nanoparticlesandmodifiedrepairtemplatesincreasegenomeeditingefficiency. NatBiotechnol.2020Jan;38(1):44-49.doi:10.1038/s41587-019-0325-6.